メタボロミクス分析により凍結中の代謝物の変化が明らかに | 深センボールドベンチャーソリューションズ株式会社

Scientific Reports volume 13、記事番号: 6022 (2023) この記事を引用

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1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

アンゼリカダフリカ (Angelica dahurica Fisch. ex Hoffm.) は伝統的な漢方薬として広く使用されており、二次代謝産物には重要な薬理活性があります。乾燥は、アンジェリカダフリカのクマリン含有量に影響を与える重要な要因であることが示されています。しかし、代謝の根本的なメカニズムは不明です。この研究では、この現象に関連する重要な差次的代謝産物と代謝経路を決定することを目指しました。タンデム質量分析計（LC-MS/MS）を備えた液体クロマトグラフィーに基づく標的メタボロミクス分析を、凍結乾燥（-80℃/9時間）およびオーブン乾燥（60℃/10時間）したアンジェリカ・ダフリカに対して実施した。さらに、一対の比較グループの共通の代謝経路は、KEEG 濃縮分析に基づいて実行されました。その結果、193 の代謝物が重要な差次的代謝物として同定され、そのほとんどがオーブン乾燥下で上方制御されたことが示されました。また、PAL 経路の多くの重要な内容が変更されたことも示されました。この研究により、アンジェリカ・ダフリカにおける代謝産物の大規模な組換え事象が明らかになりました。まず、クマリン以外の追加の活性二次代謝産物を特定し、揮発性油がアンジェリカダフリカに大幅に蓄積されたことを明らかにしました。私たちは、温度上昇によって引き起こされるクマリンの上方制御現象の特定の代謝物の変化とメカニズムをさらに調査しました。これらの結果は、アンジェリカ・ダフリカの組成と加工方法に関する将来の研究のための理論的参考資料を提供します。

伝統的な中国医学で一般的に使用されるアンジェリカダフリカには長い歴史があり、いくつかの品種が記録されています。アンゼリカ・ダフリカの機能と風味は、主にクマリン、揮発性油、多糖類などの成分によって決まることが広く知られています。重要なことに、クマリンは抗菌、抗炎症、抗がん効果と関連しています1。揮発性油と多糖類は、抗炎症作用、鎮痛作用、抗酸化作用を担っています2。医療目的に加えて、アンジェリカダフリカは化粧品や香料の原料としても使用されています3。

新鮮な漢方薬材料を収集した後、薬用以外の部分を取り除き、残ったものを時間内に乾燥させる必要があります。最適な乾燥方法と条件は、化学物質の化学的変換と生体内変換を促進して薬効成分を抽出し、良好な臨床効果への道を開く可能性があります4。乾燥は漢方薬の品質に直接影響を与える可能性があると広く信じられています。この研究で使用した 2 つの乾燥アプローチは、オーブン乾燥と凍結乾燥です。興味深いことに、真空凍結乾燥技術は主に水の昇華の原理を応用しています5。氷を直接水蒸気に変えて未結合水を除去する乾燥方法です6。これに対し、オーブン乾燥は、材料をオーブン、乾燥室、乾燥機などに入れて人工的に加熱する方法です7。したがって、各種薬剤原料の特性に応じて乾燥温度と乾燥時間を制御することができる。

アンゼリカ・ダフリカに関するこれまでの研究では、特定の乾燥方法、手順、装置が強調されていました。さまざまな乾燥プロセスを比較して、最適な乾燥方法と主要なパラメーターを評価するには、経験と多くの反復実験が必要でした。しかし、アンジェリカ・ダフリカの加工における分子レベルでの研究はほとんど未開拓のままです。ペイ L. et al. アンゼリカ・ダフリカのクマリンと揮発性油の化学成分の影響と変化を調査しました。興味深いことに、皮をむいて 60 °C の熱風で乾燥すると最良の結果が得られ、続いて皮をむいて 40 °C の熱風で乾燥し、凍結乾燥した8。同様に、Jie J. et al. は、Angelica dahurica のクマリン含有量は、40 °C よりも 60 °C の方がより多く乾燥すると報告しました9。インペラトリン (化合物 CID: 10212) およびイソインペラトリン (化合物 CID: 68081) のクマリンの成分を測定した研究 (補足表 S4) では、60 °C での乾燥に続いて 80 °C および 25 °C での乾燥で最良の結果が得られたと報告しています10。。現在の証拠によると、アンジェリカダフリカのクマリン含有量は最初は増加し、その後加工温度とともに減少し、60 °C でピークに達することが示唆されています。したがって、研究では乾燥温度 60 °C を選択しました。熱不安定性のため、高温 (> 70 °C) では薬効成分の含有量が低下することが確認されています。しかし、温度によるアンジェリカ・ダフリカの薬効成分の上方制御の根底にあるメカニズムはまだ解明されていません。

近年、メタボロミクス解析は、植物の生理学的代謝から個人のメタボロミクスの発展に至るまで、生物学の研究に適用されており、その応用は生物学的システム内の複雑な分子相互作用のより深い理解に貢献しています11。広範囲にターゲットを絞ったメタボロミクスは、非ターゲットおよびターゲットの代謝物検出技術の利点を統合し、高感度と広い範囲を示すことが文書化されています12。したがって、凍結乾燥機および乾燥機で乾燥されたアンジェリカ・ダフリカの代謝プロファイルを特徴付けることによって、アンジェリカ・ダフリカの代謝の変化と温度上昇によって引き起こされるクマリンの上方制御現象との間の機構的な関連性を提供することが可能である。

この研究では、広範囲を対象としたメタボロミクスを使用して、アンジェリカ・ダフリカのオーブン乾燥と凍結乾燥の代謝プロファイルを初めて比較し、温度上昇によって引き起こされるクマリンの上方制御現象を理解しました。これは、アンジェリカ・ダフリカの代謝産物の大規模な組換えイベントを明らかにした最初の研究であり、温度上昇によって引き起こされるクマリンの上方制御の根底にあるメカニズムの包括的な概要を提供します。

凍結乾燥品 (図 1A) とオーブン乾燥品 (図 1B) の特性から、オーブン乾燥品の方が質感が緩く、色が暗く、油分が多かったことがわかります。腺。オイルチャンバーは、分泌能力を持つ細胞のグループを表します。大量の植物代謝物が油室に保存されており、凍結乾燥よりもオーブン乾燥後により多くの代謝物が蓄積したことが示され、クマリン含有量も温度の上昇とともに増加したと推測されました。

アンジェリカダフリカのオーブン乾燥およびフリーズドライ片。 (A) 凍結乾燥品。 (B) オーブンで乾燥させた部分。

質量スペクトルデータは、ソフトウェア Analyst 1.6.3 を使用して処理されました。サンプルの代謝産物は、局所代謝データベースに基づく質量分析法によって定性的および定量的に分析されました。図（補足図S2）に示すように、MRM代謝物検出ピークマップ（多物質抽出イオンクロマトグラム、XIC）。これはサンプル内で検出できる物質を示しており、異なる色の各質量スペクトルピークは検出された代謝物を表します。各物質の特性イオンを三重四重極で選別し、検出器で特性イオンの信号強度（CPS）を取得し、MultiaQuant 3.0.3 ソフトウェアでサンプルの質量スペクトルファイルを開き、統合および補正を行います。クロマトグラフィーのピークの分析が実行されます。ピークのピーク面積（Area）は、対応する物質の相対含有量を表します。最後に、すべてのクロマトグラフィーのピーク面積積分データがエクスポートされ、保存されます。

凍結乾燥および乾燥後のアンジェリカダフリカの代謝物の変化をより深く理解するために、サンプル中の一次および二次代謝物を UPLC-MS プラットフォームで同定しました。実験では、アミノ酸と誘導体 (n = 97)、フェノール酸 (n = 143)、ヌクレオチドと誘導体 (n = 59)、カルコン (n = 6)、オーロン (n = 1)、フラバノン (n = 13)、フラバノノール (n = 5)、アントシアニジン (n = 6)、フラボン (n = 25)、フラボノール (n = 25)、フラボノイドカルボノシド (n = 2)、フラバノール (n = 3)、イソフラボン (n = 9)、キノン (n = 4)、リグナン (n = 18)、クマリン (n = 92)、糖類およびアルコール (n = 62)、ビタミン (n = 16) 、アルカロイド (n = 88)、テルペノイド (n = 40)、有機酸 (n = 81)、グリセロールエステル (n = 18)、PC (n = 1)、スフィンゴ脂質 (n = 2)、LPC (n = 33) )、LPE (n = 22)、遊離脂肪酸 (n = 73)、その他 (n = 51)。これらの異なる代謝産物の中で、アミノ酸および誘導体 (9.75%)、フェノール酸 (14.37%)、クマリン (9.25%)、アルカロイド (8.84%)、有機酸 (8.14%)、遊離脂肪酸 (7.34%) が最も多かった。豊富に存在する（図２Ｃ）。

(A) TYH、TYD、TJXH、および TJXD の代謝産物の PCA スコアプロット。 (B) TYH、TYD、TJXH、および TJXD の代謝物のヒートマップ。 (C) Angelica dahurica サンプルの 995 の代謝物の分類。

4 つのグループのサンプルにおけるすべての処理の PCA (図 2A) は、異なる乾燥アプローチの下でアンジェリカダフリカが分離されたことを実証し、代謝の違いが顕著であることを示しました。主成分 1 (PC1) と主成分 2 (PC2) は、それぞれデータの分散の 44.32% と 26.75% を占めました。これらの結果は、オーブン乾燥および凍結乾燥処理が PC1 の代謝産物の違いを説明し、異なるプランテーションサイトからのグループは主に PC2 によって分離されることを示しました。

すべてのサンプルの代謝産物のクラスターヒートマップが図 2B に表示されます。アンゼリカ・ダフリカの一部の代謝産物は、乾燥オーブンで処理すると上方制御されましたが、凍結乾燥機では下方制御され、オーブン乾燥と凍結乾燥処理の間で代謝物に大きな違いがあることが示唆されました。「含有量」のアップレギュレーションは絶対的な増減ではなく、相対的な増減です。差次的代謝産物のスクリーニング中に、グループ分け情報が A 対 B の場合、A が対照グループ、B がデータ分析の実験グループであることを意味します。差次的代謝産物の最終スクリーニングが上方制御されている場合、それは代謝産物の含有量が A では比較的低く、B では比較的高いことを意味します。4 つの主要なクラスターが得られました。クラスター 1 とクラスター 2 は、TYD と TJXD で高水準に蓄積しました。クラスター 3 と 4 は、TYH と TJXH に高レベルで蓄積しました。さらに、各グループの 3 つの生物学的複製がクラスター化されており、複製間の均一性が良好で、データの信頼性が高いことが示されました。

OPLS-DA 分析は、教師付きパターン認識を備えた多変量統計分析であり、無関係な影響を効果的に排除して、差次的な代謝産物をスクリーニングできます。 OPLS-DA スコアプロット (図 3C) では、TYD サンプルは信頼区間の左側に分布し、TYH サンプルは右側に分布しました。 OSC プロセスの主成分のコア値 (T スコア [1]) は 76.8% でした。 OSC プロセスの直交 T スコア [1] は 5.49% でした。評価モデルの予測パラメータはR2X、R2Y、Q2です。 R2X と R2Y はそれぞれ構築されたモデルの X 行列と Y 行列の解釈率を表し、Q2 はモデルの予測能力を表します。これら 3 つの指標が 1 に近づくほど、モデルはより安定します。 OPLS-DA のモデル検証 (n = 200、つまり 200 回の順列実験) (図 3D)、Q2 = 0.994 > 0.9、R2Y = 1、R2X = 0.822、P < 0.005。同様に、別の OPLS-DA スコアプロット (図 3A) では、TJXD サンプルと TJXH サンプルは明確に分離されており、モデル検証中 (図 3B)、Q2 = 0.98 > 0.9、R2Y = 1、R2X = 0.743、P < 0.005 でした。さらに、2 つのモデルは両方とも信頼できることを示しました。

差次的代謝産物の OPLS-DA ペアワイズ比較のスコアプロット: (A) TJXD 対 TJXH、(C) TYD 対 TYH。モデル検証図: (B) TJXD 対 TJXH、(D) TYD 対 TYH。

TYD 対 TYH および TJXD 対 TJXH の差次的代謝物は、最初に OPLS-DA を使用してスクリーニングされました。変化倍数値と VIP 値を包括的に使用して、差次的代謝産物をスクリーニングしました。変化倍数 ≥ 2、倍数変化 ≤ 0.5、および VIP ≥ 1 の代謝物が、有意差のある代謝物として選択されました。図 4A、B の火山プロットは、差次的代謝産物の有意な違いを示唆しており、結果の信頼性がさらに検証されました。 TJXD 対 TJXH では、258 個 (210 個が上方制御され、48 個が下方制御) の差次的代謝物が得られました。 TYD 対 TYH では、417 個 (264 個が上方制御され、153 個が下方制御) が示差的な代謝物として同定されました。補足図S1に示すように、両方のグループで、凍結乾燥よりもオーブン乾燥下でより多くの代謝物が上方制御され、生理学的および生化学的反応がオーブン乾燥によって促進されたことを示しています。補足表S1に示すように、TJXD対TJXHの選択された代謝物は、アミノ酸および誘導体（n = 27）、フェノール酸（n = 45）、ヌクレオチドおよび誘導体（n）を含む10の主要クラスと28のサブクラスに分類されました。 = 32)、フラボノイド (n = 13)、リグナンおよびクマリン (n = 12)、アルカロイド (n = 24)、テルペノイド (n = 4)、有機酸 (n = 24)、脂質 (n = 55) など(n = 22)。選択された TYD と TYH の代謝産物は、アミノ酸と誘導体 (n = 32)、フェノール酸 (n = 63)、ヌクレオチドと誘導体 (n = 49)、フラボノイド (n = 49) を含む 10 の主要カテゴリーと 36 のサブカテゴリーに分類されました。 51)、キノン (n = 1)、リグナンおよびクマリン (n = 28)、アルカロイド (n = 44)、テルペノイド (n = 8)、有機酸 (n = 32)、脂質 (n = 55) およびその他 ( n = 34)。我々の結果は、TYではTJXよりも多くの種類の異なる代謝物、特にアルカロイドとフラボノイドが存在することを示唆しており、これらはプランテーション基地の違いに起因する可能性がある。

代謝物の火山図: (A) TJXD 対 TJXH、(B) TYD 対 TYH。

共通の示差的代謝産物の同定に成功すれば、乾燥中のアンジェリカ・ダフリカの生理学的および生化学的反応を解明するのに役立つ可能性がある。前述の 2 セットの差次的代謝物に基づいて、これらのデータを組み合わせてフィルタリングしました。両方のグループ間で 193 の共通の差次的代謝産物が得られました (補足表 S2)。これらの異なる代謝産物のうち、158 個が上方制御され、35 個が下方制御され、いくつかの重要な生理学的代謝物および代謝活性がオーブン乾燥中に活性化される可能性があることを示唆しています。

これらの代謝産物は、アミノ酸および誘導体 (n = 25)、ヌクレオチドおよび誘導体 (n = 32)、フェノール酸 (n = 32)、フラボノイド (n = 12)、リグナンおよびクマリンを含む 10 の主要クラスと 24 のサブクラスに分類されました。 (n = 7)、アルカロイド (n = 21)、有機酸 (n = 21)、脂質 (n = 25)、テルペノイド (n = 1)、その他 (n = 13)。これらの代謝産物のうち、アミノ酸と誘導体、ヌクレオチドと誘導体、脂質と有機酸が植物の主要代謝産物であり、フェノール酸、フラボノイド、リグナンとクマリン、アルカロイドとテルペノイドが二次代謝産物でした。図 5 に示すように、これらの差次的に発現された代謝産物は、アミノおよび誘導体、フェノール酸、ヌクレオチドおよび誘導体、および有機酸に集中していました。ペアワイズ比較により、上方制御された代謝物の数が下方制御された代謝物の数よりも有意に多いことが示されました。さらに、二次代謝産物の数は凍結乾燥よりもオーブン乾燥の方が多く、これは加熱下でのアンジェリカ・ダフリカの生理学的および生化学的反応が生物学的または非生物的ストレス下でのアンジェリカ・ダフリカと同様であることを示しています。さらに、文献と一致して、オーブン乾燥中に 7 種類のリグナンとクマリンがすべて上方制御されました。

TYD VS TYH および TJXD VS TJXH グループ間の一般的な差次的代謝物の分類。

ペアワイズ比較グループ内のすべての差次的代謝産物を KEGG データベース (www.kegg.jp/kegg/kegg1.html.) と照合して、代謝経路情報を取得しました。 KEGG アノテーションとエンリッチメント分析が実行され、エンリッチされた経路が図 6A、B に示されています。 TJXD と TJXH の場合、これらの異なる代謝産物の豊富な代謝経路は、チロシン代謝、トリプトファン代謝、ピリミジン代謝、プリン代謝、フェニルプロパノイド生合成、フェニルアラニン代謝、およびリノール酸代謝で構成されていました。 TYD 対 TYH では、差次的代謝産物の豊富な経路には、ピリミジン代謝、プリン代謝、フェニルアラニン代謝、リジン分解およびグルタチオン代謝が含まれていました。この交差により、ピリミジン、プリン、およびフェニルアラニンの代謝が、これらの異なる代謝産物の著しく豊富な経路として得られました。プリンとピリミジンの代謝は、下流の合成に不可欠な前駆体材料の合成に関与します。具体的には、プリンおよびピリミジン塩基は、プリンおよびピリミジンの代謝中に生成され、ヌクレオチド合成の基礎物質となります。ヌクレオチドは、植物の成長、発育、代謝、および他の物質の合成において重要な役割を果たす必須の細胞成分です。さらに、プリンとピリミジンの代謝は、植物の一次および二次代謝に必要です13,14。例えば、ウリジン二リン酸（UDP）（化合物CID: 6031）はピリミジン代謝中に生成されました（図6C）。スクロースシンターゼの触媒作用により、スクロースとUDPは可逆的に反応してフルクトースとUDPグルコースを生成します。 UDP-グルコースは、UDP-グルコースグリコシルトランスフェラーゼの巨大なタンパク質ファミリーによって触媒される広範囲の反応における二次代謝産物およびホルモンの誘導体化においてグルコシル供与体として機能しました。キサントシン (化合物 CID: 64959) はプリン代謝中に生成され、テオブロミン、カフェインなどのアルカロイドの合成に関与します (補足表 S4)。

KEGG アノテーションと示差的に発現された代謝産物の濃縮: (A) TJXD 対 TJXH、(B) TYD 対 TYH。 (C) Angelica dahurica サンプルの代謝経路にマッピングされた主要な代謝産物の変化。注: 赤い色の小さな長方形は、代謝物の含有量が大幅に上方制御されていることを示します。青い小さな長方形は、代謝産物の含有量が大幅に下方制御されていることを示します。白い小さな長方形は、代謝産物の含有量に有意な差がないことを示しています。

フェニルアラニン代謝は、植物の二次代謝産物合成にとって最も重要な経路の 1 つです。我々は、フェノール酸、フラボノイド、リグナン、クマリン、および一部のアルカロイドがこの経路によって合成されることを発見しました（図6C）。フェニルアラニン (化合物 CID: 6140) はシキミ酸 (化合物 CID: 8742) によって合成されました。フェニルアラニンアンモニアリアーゼ (PAL) の作用下で、フェニルアラニンはトランス桂皮酸 (化合物 CID: 139054223) に変換されます。次に、トランス-桂皮酸は、桂皮酸 4-ヒドロキシラーゼ (C4H) の作用下で P-クマリン酸 (化合物 CID: 637542) に変換されました (補足表 S4)。トランス桂皮酸は、二次代謝産物の最も重要な前駆物質として機能します。 PAL と C4H も 2 つのコア酵素とみなされます。

現在、アンジェリカ・ダフリカの組成に関する研究は主にクマリンと揮発性油に焦点を当てています。この研究では、高感度、正確な定量的および定性的特性、および広い範囲で確立されている広範囲を対象としたメタボロミクス 15 を使用して、2 つの異なる乾燥方法に従って 2 つのプランテーション基地でアンジェリカダフリカの代謝産物を同定しました。異なる乾燥方法がアンジェリカ・ダフリカの品質に及ぼす影響に関する他の研究と比較して、クマリンの調査を目的として、対照グループとして凍結乾燥を、実験グループとしてオーブン乾燥を使用して、2つの乾燥方法で生成される異なる代謝産物を明らかにしました。アシタバの温度による変化を代謝の観点から観察した。 995 個の代謝物をスクリーニングし、そのうち 27 個が 4 つのグループのそれぞれで上位 50 に入っていました (補足表 S3)。生物の通常の活動を維持する一次代謝物を除き、ほとんどの二次代謝物はクマリンクラスに属していました。他のクラスの二次代謝産物も同定されました。例えば、キク属コロナリウム L. およびコニオグラム・ジャポニカの根茎から単離されたプテロラクタム (化合物 CID: 181561) はピロールアルカロイドに分類されており、最近の研究では抗菌活性があることが示されています。アンカ＝エレナ・ダスカルほかは、9 つの真菌株と 3 つの非アルビカンスカンジダ酵母種のパネルに対するプテロラクタムの抗真菌活性を評価しました 16、17、18。 L-ピペコール酸 (化合物 CID: 439,227) は L-リジン異化の中間体であり、その中心注入は脳に催眠効果を及ぼすことが報告されています 19。さらに、それは医学的問題、根圏生態学、汚染土壌の除染、栄養素の獲得および植物の抵抗性において重要な役割を果たしています20、21、22、23。同時に、アンジェリカ・ダフリカにはクマリンと揮発性油のほかに、含有量、薬理学的効果、および応用価値が高い二次代謝産物がまだいくつかありました。この研究は、アンジェリカ・ダフリカの他の物質に関する将来の研究のための理論的参考資料を提供します（補足表S4）。

広範囲に対象を絞ったメタボローム分析により、一度に約 1,000 個の代謝物の定量的検出が可能となり、代謝物の差異の包括的かつ効果的な比較や代謝経路の分析に役立つことが確立されています 24。示差的代謝物分析により、10 の主要なクラスに分類される 193 個の示差的代謝物が得られました。これらの異なる代謝産物のうち、158 個が上方制御され、35 個が下方制御されました。脂質では、脂肪酸は上方制御されていましたが、リノール酸とリノレン酸からなるグリセロールエステルは下方制御されていました。飽和脂肪酸の割合が増えると脂質の融解温度が高くなり、熱による膜流動性の増加が妨げられる可能性があるため、脂肪酸の飽和レベルの増加は膜の安定性と耐熱性の維持にプラスの効果をもたらします25。リノール酸とリノレン酸は植物膜の主要な脂肪酸です26。したがって、処理温度の上昇により、アシタバの細胞膜が損傷した後、リノール酸およびリノレン酸の含有量が減少し、一方、脂肪酸含有量の増加により、熱による膜流動性の増加が防止されるのではないかと推測されます。さらに、文献と一致して、クマリンが上方制御されました。 KEGG アノテーションとエンリッチメントの結果に基づいて、ピリミジン代謝、プリン代謝、フェニルアラニン代謝という 3 つの代謝経路がこれらの重複する差次的代謝産物にマッピングされました。プリンとピリミジンの代謝が上流の物質の合成に関与していることを考慮して、次にフェニルアラニンの代謝経路について説明しました。

非生物的または生物的ストレス下にある植物の主要な二次代謝産物の 1 つであるフェニルプロパノイドの生合成経路は、植物を攻撃から守るためにフラボノイド、リグナン、フェノールなどの多数の抗酸化物質を生成すると報告されています 27,28。 UV-C 照射は、スイートチェリー (Prunus avium L.) のフェニルプロパノイド経路の遺伝子発現を増加させることがわかっています 29。この研究では、温度の上昇によりフェニルプロパノイド生合成が大幅に促進されました。フェノール酸では、桂皮酸、p-クマリン酸、p-クマアルデヒド、p-クマリルアルコール、ヒドロ桂皮酸、2-ヒドロキシ桂皮酸、4-メトキシ桂皮酸など、フェニルアラニンの第 1 および第 2 代謝産物とその誘導体が増加しました。フェニルアラニン経路の活性化を実証し、フラボノイド、クマリン、リグニンの増加のための前駆体物質を提供しました。それはおそらく PAL および C4H30,31 の活性化に関連していると考えられます。さらに、没食子酸 (化合物 CID: 370) などの他の蓄積されたフェノール酸には、抗がん作用、抗炎症作用、肝臓保護作用があると報告されています 32。フラボノイドは、フリーラジカルスカベンジャー、還元剤、水素供与体、および一重項酸素クエンチャーとして作用し、高い抗酸化特性を示します 33。ケンフェロール-3-O-グルコシド (化合物 CID: 5282102) とカテキン-5-O-グルコシド (化合物 CID: 44257081) は、強力な抗酸化活性があることが十分に証明されている 2 種類のフラボノイド 34 であり、顕著に増加し、酸化を防ぐのに貢献しました。本研究における加熱（補足表S4）。

私たちの研究では、クマリンとリグニンはすべて上方制御されており、これらはフェニルアラニンの代謝によって生成されます。フェニルアラニン代謝経路は酵素反応であり、PAL はフェニルアラニン代謝の中心酵素です。通常の状況下では、植物におけるPAL発現は低く、通常、高温、機械的損傷などの生物的または非生物的ストレスに反応して増加します。したがって、PALはアンジェリカ・ダフリカの加熱乾燥中に活性化され、フェニルアラニンを促進すると推測するのが合理的です。代謝とクマリンとリグナンの含有量の増加35。クマリンは、アンジェリカダフリカの主要な薬理学的物質としてよく知られています。差次的代謝産物の中で大幅に増加したクマリンには、ヒト末梢単核細胞の増殖反応を低下させ、平滑筋を弛緩させ、総コレステロールとトリグリセリドを低下させるために以前に確立されたスコパロン（化合物CID：8417）（補足表S4）などの特定の薬理学的効果があり、高コレステロール血症の糖尿病ウサギの特徴的な病態形態学的変化を遅らせる36。ソラレン誘導体であるメトキサレンは、乾癬やその他の皮膚疾患に優れた治療効果があります37。観察されたクマリンの上方制御は文献と一致しており、上方制御されたクマリンの分析により、アンジェリカダフリカの最適な乾燥アプローチの特定が可能になります。リグニンは、フェニルプロパノイド経路によって合成されるモノリグノールの酸化的カップリングを介して発生します。これは植物の二次細胞壁の必須成分であり、細胞構造を強化します。したがって、リグニンの蓄積は高温への耐性に関連していると推測されます 38,39。

フェニルアラニン経路によって生成される二次代謝産物の有意な違いに加えて、21 個のアルカロイド成分が大きく変化し、そのうち 19 個が上方制御されました。アルカロイドは、広範囲の生化学反応を通じてアミノ酸から形成されます。変化したアルカロイドは主にトリプトファン、フェニルアラニン、オルニチンの代謝に由来し、アミノ酸化合物の異なる代謝産物と一致します。アミノ酸代謝はタンパク質合成の経路であり、一部の代謝産物の中間体として機能し、さまざまな代謝経路の制御に関与し、それによって植物の多くの生理学的プロセスに影響を与えることがわかります。さらに、ベタインやノルガランタミンなどの上方制御されたアルカロイドは、多くの薬理学的活性を示します 40。

この研究にはまだいくつかの限界があります。植物のメタボロームは植物の発育を制御する 200,000 を超える代謝産物で構成されており、シロイヌナズナでさえ 5000 の代謝産物を含んでいることは広く知られています 41。したがって、アンジェリカダフリカは、本研究で特定された 995 を超える代謝産物で構成されています。この矛盾は、大規模な公的漢方薬代謝物データベースの欠如に起因する可能性があります。さらに、アンジェリカダフリカのもう 1 つの主な有効成分は揮発性油です。ただし、UPLC-MS/MS 分析では、揮発性オイルの検出には限界があります。今後の研究では、揮発性油に重点を置いてアンジェリカ・ダフリカのメタボロームを解析する必要がある。 PAL、4-クマレート-CoA リガーゼ (4CL)、および C4H 酵素がフェニルプロパノイド経路活性化の鍵であるかどうかを検証するには、さらなる研究が必要です。全体として、この研究は、アンジェリカ・ダフリカに含まれる他の物質の研究に理論的参考資料を提供し、加工中の特定範囲内の温度上昇によりクマリンが強化されることを裏付け、臨床応用のためのアンジェリカ・ダフリカの品質に関する新たな洞察を提供する。

植物材料は、中国四川省遂寧市の太一基地（TY）と唐家祥基地（TJX）の異なる植栽地から収穫されたもので、成都中医薬大学のジン・ペイ教授によってアンジェリカ・ダフリカと特定された。そして、国家の伝統的な中国医学の生殖質資源バンクに保管されています。次に、2 つのフィールドからの実験材料をそれぞれ凍結乾燥および 60 °C でオーブン乾燥しました。収集されたすべてのサンプルは、TY とオーブン乾燥 (TYH)、TXJ とオーブン乾燥 (TJXH)、TY と凍結乾燥 (TYD)、および TJX と凍結乾燥 (TJXD) の 4 つのグループに分けられました。採取後、サンプルを 4 つのグループに均等に分配し、各実験で 3 回の反復を実行しました。

この研究におけるアンジェリカ・ダフリカの収集は、絶滅の危機に瀕している種に関する研究に関するIUCNの政策声明および絶滅の危機に瀕している野生動植物の種の取引に関する条約に準拠し、遵守しています。また、中国国家林業草原局発行の国家重点保護野生植物リストによると、今回の実験材料であるアンジェリカ・ダフリカは絶滅危惧種でも国家重点保護野生植物でもない。また、四川省遂寧泉台堂製薬有限公司より植物採取の許可を得ております。

サンプル調製や代謝産物の抽出などの関連実験は、Wuhan Maitville Biotechnology Co., Ltd.によって実施されました。生体サンプルは真空凍結乾燥機 (Scientz-100F) で凍結乾燥され、オーブン (DHG-9140A) で加熱乾燥されました。ジルコニアビーズを備えたミキサーミル（MM 400、Retsch）を使用して、サンプルを30 Hzで1.5分間粉砕した。 100 mg の粉末を 1.2 mL の 70% メタノール溶液に溶解し、30 分ごとに 30 秒間、合計 6 回ボルテックスしました。サンプルを 4 °C の冷蔵庫に一晩置きました。 12,000 rpmで10分間遠心分離した後、UPLC-MS/MS分析の前に、抽出物を濾過しました(SCAA-104、細孔径0.22μm; ANPEL、上海、中国、(http://www.anpel.com.cn/))。。

サンプル抽出物は、UPLC-ESI-MS/MS システム (UPLC、SHIMADZU Nexera X2、(https://www.shimadzu.com.cn/); MS、Applied Biosystems 4500 Q TRAP、(https:// www.thermofisher.cn/cn/zh/home/brands/applied-biosystems.html) 分析条件は次のとおりです: UPLC: カラム、Agilent SB-C18 (1.8 µm、2.1 mm * 100 mm) 移動相溶媒 A、0.1% ギ酸を含む純水、および溶媒 B、0.1% ギ酸を含むアセトニトリルで構成されたグラジエントプログラムは次のとおりでした: 0 分で 95:5 V/V、11.0 分で 5:95 V/V 、12.0 分で 5:95 V/V、12.1 分で 95:5 V/V、その後、組成を 1.1 分以内に 95% A および 5.0% B に調整し、2.9 分間維持しました。流速は次のように設定されました。 0.35 mL/分、カラムオーブンは 40 °C、注入量は 4 μL、流出液は ESI-トリプル四重極線形イオントラップ (QTRAP)-MS に接続しました。

ESI ソースの動作パラメータは次のとおりです。イオン源、ターボスプレー。ソース温度 550 °C。イオンスプレー電圧 (IS) 5500 V (正イオンモード)/-4500 V (負イオンモード)。イオンソースガス I (GSI)、ガス II(GSII)、カーテンガス (CUR) はそれぞれ 50、60、25.0 psi に設定されました。衝突活性化解離 (CAD) が高かった。 QQQ スキャンは、衝突ガス (窒素) を中程度に設定した MRM 実験として取得されました。個々の MRM 移行の DP と CE は、さらに DP と CE を最適化して実行されました。この期間内に溶出された代謝物に従って、特定の MRM 遷移セットが各期間で監視されました。

代謝物構造解析は、自己確立されたデータベース HWDB に基づいていました。質量分析法で検出された一次スペクトルと二次スペクトルは定性的に分析され、K + イオン、Na + イオン、NH 4 + イオン、およびそれ自体より大きなフラグメントイオンの繰り返しシグナルを含む同位体シグナルが一部の物質の分析中に除去されました。分子量物質の繰り返し信号。

代謝物の定量化は、QQQ 質量分析計の MRM モードを介して実行されました。

代謝データの処理には、主成分分析 (PCA)、階層クラスター分析 (HCA)、直交部分最小二乗判別分析 (OPLS-DA) などのさまざまな統計分析方法が使用されました。 PCA は R 関数「prcomp」(www.r-project.org) によって実行されました。サンプルと代謝物の HCA 結果は、樹状図を含むヒートマップとして表示され、R パッケージ Complex Heatmap によって実行されました。 HCA の場合、代謝産物の正規化された信号強度 (単位分散スケーリング) がカラースペクトルとして視覚化されました。 VIP 値は、ソフト R を使用して生成されたスコアプロットと順列プロットで構成される OPLS-DA 結果から抽出されました。同定された代謝物には、KEGG Compound データベース (http://www.kegg.jp/kegg/compound/) を使用して注釈が付けられました。次に、注釈付きの代謝産物を KEGG データベース (http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html) にマッピングしました。

TYD、TYH、TJXD、および TJXH で合計 995 個の代謝物が検出されました。その中には、アンジェリカ・ダフリカのクマリンと揮発性油の他に、含有量、薬理効果、応用価値が高く、将来の研究に使用できる二次代謝産物がまだありました。さらに、193 個の示差代謝物が重要な示差代謝物として同定され、そのほとんどがオーブン乾燥下で上方制御されました。 KEEG アノテーションと濃縮分析により、適度な加熱によりフェニルアラニン経路が促進され、その結果クマリン含有量が増加することが示され、確立された潜在的な代謝物ネットワークによりこの現象が明らかになりました。同時に、プリンおよびピリミジン経路の活性化により、重要な価値を持つほとんどの一次および二次代謝産物が上方制御されます。それにもかかわらず、PAL、4-クマレート-CoA リガーゼ (4CL)、および C4H がどのように作用するかどうかを検証するには、さらなる研究が必要です。酵素はフェニルプロパノイド経路の活性化の鍵となります。

現在の研究中に使用および/または分析されたデータセットは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

4-クマレート-CoA リガーゼ

シンナメート 4-ヒドロキシラーゼ

衝突活性化解離

カーテンガス

ガスI

ガスⅡ

階層的クラスター分析

液体クロマトグラフィータンデム質量分析法

直交部分最小二乗判別分析

フェニルアラニンアンモニアリアーゼ

主成分1

主成分2

主成分分析

四重極線形イオントラップ

ウリジン二リン酸

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受信日: 2022 年 5 月 29 日

受理日: 2023 年 3 月 27 日

公開日: 2023 年 4 月 13 日

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